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Oct 21, 2023

殺菌剤

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8431 (2023) この記事を引用

345 アクセス

3 オルトメトリック

メトリクスの詳細

真菌属 Alternaria は、100 を超える作物に広がる汎世界的な病原体であり、リンゴ (Malus xdomestica Borkh.) で世界的に拡大している Alternaria 葉斑病と関連しており、重度の葉壊死、早期落葉、多大な経済的損失を引き起こします。 現在に至るまで、多くのアルタナリア種の疫学はまだ解決されていません。それらは腐生性、寄生性、または両方のライフスタイルの間で移行する可能性があり、健康な組織に感染する可能性のある主要な病原体としても分類されているためです。 私たちは、Alternaria spp. 主要な病原体としては作用せず、壊死依存性の日和見菌としてのみ作用します。 私たちはAlternaria spp.の感染生物学を研究しました。 管理された条件下で実際の果樹園で病気の蔓延を監視し、3年間の野外実験で殺菌剤を使用しない処理を適用することで私たちのアイデアを検証しました。 アルタナリア属分離株は健康な組織に壊死を誘発できませんでしたが、それは以前に誘発された損傷が存在した場合のみでした。 次に、葉に散布した肥料は、殺菌効果はなく、殺菌剤と同じ有効性でアルテルナリア関連症状を軽減しました (- 72.7%、SE: ± 2.5%)。 最後に、葉のマグネシウム、硫黄、マンガンの濃度が低いことは、一貫してアルテルナリア関連の葉斑症と関連していました。 果実の斑点発生率は葉斑病と正の相関があり、肥料処理によっても減少し、他の真菌媒介疾患とは異なり、保存中に拡大しませんでした。 私たちの調査結果は、Alternaria spp. 生理学的に誘発された葉斑点にコロニーを形成すると思われるため、葉斑点の主な原因ではなく葉斑点の結果である可能性があります。 Alternaria 感染が宿主の弱体化に関連しているという既存の観察を考慮すると、この違いはわずかに見えるかもしれませんが、(a) さまざまなストレスがどのようにして Alternaria 種の定着を引き起こすかのメカニズムを説明できるため、非常に重要です。 (b) 基本的な葉っぱ肥料の代わりに殺菌剤を使用します。 したがって、私たちの発見は、特に同じメカニズムが他の作物に当てはまる場合、殺菌剤の使用の削減により環境コストの大幅な削減につながる可能性があります。

汎世界的な属である Alternaria は腐生性菌類で構成されており、特に宿主植物が弱ってストレス下にある場合、さまざまな作物に対して病原性を示す可能性があります 1,2,3。 ジャガイモ、トマト、小麦、キャベツ、ヒマワリ、綿、大豆、リンゴなどの主要作物を含む宿主植物種は 100 種を超えており、これらの植物では通常、真菌が壊死性病変を引き起こします4、5、6、7、8。 Alternaria は宿主範囲が広いため、世界中で最も有害な病原体の 1 つです。 リンゴ (Malus xdomestica Borkh) では、Alternaria 関連の症状には葉の斑点とその後の果実の斑点が含まれ、果樹園ごとに 85% の落葉と最大 80% の果実の寄生につながる可能性があり (補足図 1)、巨額の経済的損失につながる 1,7 、9、10、11。 アジアでは、リンゴ生産にとって経済的に最も重要な病気であると考えられています12,13。 世界的に見て、リンゴの生産は「ゴールデン デリシャス」、「レッド デリシャス」、「フジ」、「ガラ」といういくつかの品種によって占められています。 これらの上位 4 品種は世界生産量の 60.3% を占めており (データの質が不確かな中国を除くと、50.8%、データ 2015 年)、そのすべてがアルタナリア葉斑病の影響を受けやすく、この病気の影響を悪化させています 14。 15、16。 さらに、Alternaria spp. に言及することが重要です。 カビ核病などのリンゴの他の病気を引き起こす可能性があり、果実の内部品質に影響を与え、収穫後の保管中にリンゴ栽培者や生産者に重大な経済的損失をもたらします10、17、18。

1926 年（米国）にリンゴのアルタナリア葉斑病に関する最初の報告がなされて以来、この病気は世界中のリンゴ栽培地域（アジア、ロシア、オーストラリア）に広がり、まず南ヨーロッパを含む乾燥した温暖な気候の地域に広がりました19。最近では温帯地域も含まれています (例: オランダ、2018)9,11,14,19,20,21,22,23。 アルタナリアの葉斑病の発症には暖かい条件と発情期が必要であり、最初の症状は通常初夏に発生します（補足図1aおよび2）。 その後の降雨と夏の終わりの気温の低下により、症状が劇的に増加し（補足図1b）、重度の落葉（補足図1c）と果実の斑点（補足図1d）につながります12。 その重要性にもかかわらず、リンゴにおけるアルタナリアの疫学はまだ十分に理解されていません。 その結果、アルタナリア病を制御するための植物保護戦略は特異的ではなく、多くの場合効果的ではありません。 農家は収穫保険戦略として、定期的に殺菌剤を散布し、生育期ごとに最大 8 回の処理を行っています 17,24。 しかし、現在の農業政策は、農薬の使用を大幅に削減することを目指している（例えば、2030年までに最大50％削減；欧州委員会）。特に合成農薬は、対象外の生物や土壌汚染に対する最も顕著な脅威の1つであるためである。水25、26、27、28、29、30。 したがって、現在、食糧安全保障を守るための植物保護における代替アプローチが強く求められています。

重要なのは、Alternaria の葉斑点の症状は、「生理的 (または壊死性) 葉斑点」として説明されている、あまり知られていないリンゴの生理学的疾患と非常によく似ていることです 13,17,31。 どちらの病気も、同様の葉の壊死斑点、同じ病気の進行、病気の発生に有利な同様の気候条件によって特徴付けられます（補足の「考察」：2つの病気、同じ症状、図1a、bも参照）。 生理的な葉斑は、夏の発情期後の気温低下によって引き起こされる、葉の栄養バランスの不均衡によって引き起こされると考えられています13,31。 初期の研究では、亜鉛とマンガンを含む有機殺菌剤（ジチオカルバメート）、およびマグネシウムとマンガンの葉面肥料による処理が生理学的葉斑を軽減できることが示されました 32。 対照的に、マグネシウム摂取の拮抗薬であるカリウム肥料は落葉を増加させました33。 しかし、これらのこれまでの研究では、この病気の原因が栄養バランスの乱れであるかどうか、またその原因がどのようなものかは解決されず、効果的な治療法も開発されませんでした 31,34。 さらに、異なる作用機序の殺菌剤（FRAC コード: 3 および P 09）も生理的葉斑を軽減しましたが、病原体は特定されませんでした 35,36。

リンゴの（Alternaria）葉と果実の斑点形成に関する既存の仮説と、私たちの新しい仮説である合成、Alternaria-complex を説明する概念モデル。 同じ症状の発生については 2 つの既存の仮説があります: (A) Alternaria 葉斑点の病原体仮説 (生物的)、および (B) 生理学的葉斑点仮説 (非生物的)。 我々は、(C) Alternaria 複合体の両方の合成を提案します。 環境要因により、葉斑点 (Ci) の形成による栄養素の不均衡が引き起こされ、その後、Alternaria spp.が定着する可能性があります。 (C-ii)。 活性剤の薬害やワクモなどの他の要因も、Alternaria spp.にとって必要な条件を形成する可能性があります。 植民地化（C-iii）。 未知の引き金によって腐生生命体がアルテルナリア属の病原性生命体（毒素産生）に変化し、その結果として典型的な症状が増強される可能性があります。 同様に、果点形成（D）についても同様です。 損傷を受けた皮膜は、Alternaria spp.による定着の必須の前提条件であり、その結果として症状が現れます。

要約すると、Alternaria の葉斑点、生理的葉斑点、および果実の斑点の原因はほとんど理解されていません。 さらに、これまでの仮説は既存の証拠と矛盾しています。つまり、葉斑病が純粋に Alternaria spp. によって引き起こされたのであれば、ということです。 感染している場合、葉に散布した肥料には殺菌作用がないので、影響を受けるべきではありません。 同様に、栄養素の不均衡が唯一の原因である場合、異なる作用機序を持つ殺菌剤が葉斑点の重症度を軽減するのはなぜでしょうか? 症状の類似性を考慮して、新しい合成を提案します。 我々は、生理的葉斑病と Alternaria 葉斑病は 2 つの相互に関連した病気である、つまり Alternaria 複合体であると仮説を立てています。 リンゴの木の栄養バランスの不均衡によって引き起こされる初期の葉壊死（図1cに示す）は、その後のAlternaria spp.による定着の必要条件であり、これにより病気の重症度が悪化する可能性があります。

我々は、(1) この病気に関連する明確な葉の栄養素の兆候がある、(2) Alternaria spp. がこの病気に関連していると予測します。 既存の壊死がなければ健康なリンゴ組織に感染することはできない、(3) Alternaria 関連の病気は、葉の肥料によって最初の葉の壊死を防ぐことで制御できる、ということです。

私たちは、1999年以降葉斑病がますます蔓延していた南チロル（イタリア）のリンゴ園で葉斑病の発生を調査しました。 どの葉の栄養素が最初の葉斑を引き起こす可能性があるかを明らかにするために、ランダム フォレスト分析を使用して、葉の栄養素濃度 (N、P、K、Ca、Mg、S、B、Fe、Mn、Cu、および Zn) を葉斑の重症度に関連付けました (詳細な分析については、補足結果 S1、補足図 4 ～ 6、補足表 5 を参照してください。

このデータは、アルタナリア属の菌に感染しやすいリンゴ品種「ゴールデン デリシャス」と「クリップス ピンク」の両方の成熟木から得られたもので、以下に説明する野外実験で使用されました。 予測因子から、両方の品種において、低い硫黄濃度はより深刻な葉斑と一貫して関連していました（図2a）。 ただし、硫黄とマグネシウムはデータセット内で強い共線性があり（r = 0.78、補足図4）、モデル選択（AICに基づく）では駆動要素として硫黄が強く支持されていたにもかかわらず、マグネシウムの潜在的な役割を除外することはできません（補足結果） S1)。 さらに、マンガン濃度が低いことも葉斑病の重症度と関連していましたが、これは「ゴールデンデリシャス」のみでした（図2b）。 これらの結果を独立したデータで検証するために、前年の葉斑発生率が高かったか低かった調査地域内のペアの「ゴールデンデリシャス」果樹園の葉の栄養状態を比較しました。 この分析により、発生率の高い果樹園は実際、葉の硫黄、マグネシウム、特にマンガンの濃度が低いことと関連していることが示されました（補足結果S2、補足図7および8）。

葉斑点の重症度と葉の栄養濃度の関係。 硫黄 (a) とマンガン (b) には有意な関係が見つかりました。 葉の斑点が対数スケールでプロットされていることに注意してください。 「ゴールデンデリシャス」（オレンジ）および「クリップスピンク」（ピンク）のリンゴ品種には別個の系統が適合した。 太い色付きの線は近似回帰を示し、点線は SE を示します。 灰色の点線は視覚補助としてのみ示されています。 詳細な分析については、補足結果 S1 を参照してください。

次に、アルタナリア病の感染生物学を研究しました。 私たちは、管理された条件下で Alternaria spp. が存在するかどうかをテストしました。 健康な、または損傷した葉や果実の組織に感染する可能性があります。 最初に、4 つの異なる Alternaria spp の胞子懸濁液 (1.25 × 106 胞子/ml) を使用してリーフディスクアッセイを実施しました。 元々はリンゴの葉斑点と果実の斑点から分離された分離株 (Armitage et al. 2015 によって分類された 2 つの A. alternata sspp. tenuissima と 2 つの A. alternata sspp. arborescens)。 ただし、このアッセイでは、健康な組織でも、ペンチで手動で損傷した葉のディスクでも、葉の壊死は発生しませんでした（補足図9;補足表7）。 分離株は葉ディスク表面の上部に密な菌糸体を発達させたにもかかわらず、感染の兆候（葉の表皮の黄変または褐変）は見つかりませんでした（補足図1f）。 葉が以前にヨーロッパワクモ（Panonychus ulmi;葉を吸って損傷する）によって攻撃され、損傷されていた場合にのみ、壊死が形成されました（補足図S9）。

2 番目の実験室アッセイでは、リンゴ果実に Alternaria spp. の高密度の胞子懸濁液を人工的に接種しました。 (A. alternata sspp. arborescens; 1.25 × 106 胞子/ml)、元々は感染した果実から分離されました。 恒温室（25°C）で12日間保管した後、果物の斑点も感染の兆候（壊死斑点、カビ）も検出されませんでした（補足図10）。 これは、リンゴに壊死していない新鮮な傷がある場合にも当てはまり、文献によると、感染を促進するはずです7。 3 番目のアッセイでは、保存中 (室温、約 15 ～ 20 °C) に果物の斑点の数とサイズが拡大するかどうかを調査しました。 この目的のために、感染した果物と健康な果物を一緒に箱の中で表面接触させて 2 か月間保管しました。 ここで、健康な（対照）果物には果物の斑点は発生せず、感染した果物の果物の斑点の数は保管中に変化しませんでした（補足図11）。 したがって、保存中に果実の斑点の数やサイズが増加することはありませんでした。

要約すると、我々の研究では、管理された条件下では、Alternaria 分離株 (A. alternata sspp. tenuissima および A. alternata sspp. arborescens) は健康な組織や新鮮な傷には感染できず、葉の症状を再現することもできなかったことがわかりました。葉にも果実にも斑点や斑点がある。

Alternaria spp.における葉壊死の役割を調査すること。 発生が懸念されることから、2019年7月に「ゴールデンデリシャス」の樹木で圃場実験を実施しました。 除草剤（カルフェントラゾンエチル）を使用して葉の斑点を誘発し、これがアルテルナリア属の発生につながるかどうかを調べました。 9月には、アルタナリアの胞子の密度は、自然に発生するアルタナリアの葉斑よりも除草剤誘発性の葉斑の方が平均して14倍高かった（補足図12）。 10月には、天然のアルタナリアの葉斑点で胞子密度が増加しましたが、除草剤誘発性の葉斑点よりも依然としてかなり（2.7倍）低く（補足表8）、既存の壊死が重要な前提条件であることを示しています。定着とその Alternaria spp. その後、壊死が広がります。

私たちの仮説を検証するために、リンゴ園で 3 年間にわたる野外実験を実施しました。 「ゴールデンデリシャス」品種と「クリップスピンク」品種の両方の成熟木に、殺菌効果のない特注の硫黄ベースの葉っぱ肥料を適用しました（インビトロ殺菌活性スクリーニングでテスト、補足表1、補足図15）。従来の（「統合生産」）栽培慣行の下で殺菌剤を使用したか、またはどちらも使用しなかった（対照）。 3 年間にわたって、葉肥料は両方のリンゴ品種で Alternaria の葉斑を平均 72.7% (SE: ± 2.5) 減少させました (図 3、p < 0.001; 補足表 2)。 この減少は、一般的に使用される殺菌剤によって達成されるものと同じでした (72.7%、SE: ± 3.3)。 硫黄ベースの葉面肥料も「ゴールデン デリシャス」の果実の斑点を減少させました (50.2%、SE: ± 7.3、p < 0.001、補足表 3)。一方、殺菌剤は平均 75.9% (SE: ± 4.6) の減少につながりました。 (図 3、p < 0.001、補足表 2)。 対照的に、「クリップス ピンク」の果実の斑点はまれであり (「ゴールデン デリシャス」より発生率が 111 分の 1)、果実の斑点に対する葉肥料の減少効果は検出できませんでした (p = 0.721)。 「ゴールデンデリシャス」では、3年すべてで葉の斑点と果実の斑点の間に正の相関関係が見つかりました（r = 0.53〜0.78、補足図3、補足表4）。

殺菌剤または硫黄ベースの葉面肥料（SBF）を使用すると、アルテルナリアに関連する葉斑点と果実の斑点が相対的に減少します。 2 つのリンゴ品種「ゴールデン デリシャス」(オレンジ色、肥料: 硫酸塩混合) と「クリップス ピンク」(ピンク レディー®'、ピンク色、肥料: 微粒子硫黄) における殺菌剤と SBF の有効性を従来の方法 (対照、点線) と比較して示しています。ゼロのライン）。 実地試験は、2017年から2019年にかけてイタリア、南チロルのライムブルク研究センターでランダム化ブロックデザイン（治療ごとにn = 4）で実施されました。 両方の品種の葉斑点の減少は、すべての年にわたって有意でした（p < 0.0001、補足表 2）が、果実の斑点の減少は「ゴールデンデリシャス」でのみ有意でした（補足表 3）。 「クリップス ピンク」の果実の斑点は、存在しないことは非常にまれでした (対照: 斑点の平均数フルーツ-1 ± SE: 0.0092 ± 0.0049; 補足図 14 を参照)。そのため、相対的な減少を計算するのは不適切でした。

私たちの研究に基づいて、私たちは、Alternaria spp. が細菌であるという広く受け入れられている概念に疑問を呈する証拠を発見しました。 これは、リンゴのアルタナリア葉斑病の主な直接原因であり、この病気がこれまで考えられていたよりも複雑であることを示唆しています。 私たちの発見は、健康な組織への人為的接種が失敗し、保存中に果実の斑点が拡大しなかったため、真菌が一次病原体として機能するという考えに矛盾します。 さらに、葉の栄養素濃度の低下と病気の発生率との間に強い関連性があることも観察されました。

さらに、私たちの研究は、真菌の増殖を阻害しない単純な硫黄ベースの葉面肥料が、殺菌剤と同じ効果でアルテルナリアの葉斑病を軽減できることを示しました。 肥料は植物の生理学的状態を強化し、真菌には直接作用しないため、肥料が病気の主な原因を治療し、アルタナリア感染は二次的な症状であると考えられます。 これに基づいて、我々は、生理的葉斑病とAlternaria葉斑病は別個の疾患ではなく、むしろ連続体の一部であるという新しい総合を提案し、我々は「Alternaria-complex」と呼んでいます。 この連続的な概念は、病気の誘発と増殖の多因子性を認識し、病気の発症に関与する生理学的因子と真菌因子の両方を考慮することの重要性を強調しています（図 1）。

私たちは、遍在するアルテルナリアの胞子は既存の葉の壊死を定着させ、これらの壊死を単独で開始することはできないと主張します。 むしろ、最初の葉の斑点は主に葉の栄養分の不均衡によって引き起こされます（図1c-i）。 しかし、初期の葉壊死は他のメカニズムによっても形成される可能性があり、たとえば、特定の気象条件中に噴霧される特定の活性剤は植物毒性効果を有する可能性があります（図1c-ii）37、38、39。 最初の葉の斑点の原因とは無関係に、遍在するアルテルナリアの胞子は、潜在的に毒素（アルテナロール、アルテヌエン、テヌアゾン酸など）の放出を介して、その後定着して既存の壊死を拡大し、早期の落葉を引き起こす可能性があります（図1c-iii）。収量損失 40、41、42、43、44。 同じメカニズムが果実の斑点形成にも当てはまる可能性が高く、損傷前の皮膜のみが Alternaria spp によって定着する可能性があります。 (図1d)。 Alternaria spp.のこの日和見的な病原性の役割は、 さまざまな殺菌剤が葉や果実の症状を軽減する理由は、病気の進行で説明できますが、アルタナリアの初感染が最初の原因ではありません。

この総合は、アルタナリア病に関連する一貫性のない複雑な結果の包括的な説明を提供するため、元の競合する仮説に比べて大幅な改善を示しています (補足の「考察: 2 つの不適切な仮説」を参照)。

私たちの感染実験は、管理された条件下で限られた数の分離株を用いて実施されたものであり、したがって、Alternaria spp.間の考えられる相互作用のほんの一部にすぎないことを認めたいと思います。 そしてリンゴの宿主植物。 さらに、Alternaria spp.の他の感染実験の結果には大きなばらつきがあり、一部の研究では症状や不一致が見られず人工接種に失敗したと報告されているが14、45、46、47、その他の研究では症状があり接種に成功したと報告されている15、48、49。 50. Alternaria spp.のさまざまな病原性 (感染の成功と失敗) これは通常、Alternaria 株、具体的には A. alternata の「病型」によって説明され、病原性因子として作用する宿主特異的毒素や、テヌアゾン酸やアルタラニオールなどの定着因子として機能する宿主特異的毒素などのさまざまな代謝産物を産生する可能性があります 41,42,51,52。 これらの毒素は、植物組織に直接適用されると、数時間以内に細胞死や壊死を引き起こす可能性があります40、44、53。 残念ながら、我々の人工接種研究は、使用した分離株の代謝特性評価を行わずに実施されており、接種の失敗は、これらの分離株の毒性が低いことが原因である可能性があります54。

アルタナリア研究の現状を考慮すると、特にアルタナリア属の病原性の特徴付けに関して、毒素と毒性試験に重点を置くことを再検討することが重要であると考えます。 そしてコッホの公準の実現のために。 私たちは、Alternaria spp.の感染生物学の正確な解釈を確実にするために、この方法の批判的な検査が必要であると信じています。 「剥離葉バイオアッセイ」または「病原性バイオアッセイ」では、この直接的な毒素効果を使用して、Alternaria 株の病原性 (病原型対非病原型) を推測します 9,55,56。 それにもかかわらず、これらのアッセイは、(a) 感染の生物学的プロセス、つまり「接触を確立して栄養素を獲得する」ための胞子の発芽と宿主の組織への菌糸の侵入を追跡しないため、いくつかの課題を引き起こす可能性があります1。 これは、病原性アッセイは通常、創傷組織に対して行われ、場合によっては精製毒素を使用し、真菌を使用せずに行われるためです9,23,40,42,48,53,55,57。 さらに、(b) これらのアッセイで引き起こされた葉の壊死 (葉脈、広範な壊死) は、野外での葉の斑点 (同心円状の斑点) とは症状的に非常に異なります 45、46、55、56、58。 最後に、(c) これらの壊死はサイズが一定のままであり、菌糸プラグを接種材料として使用した場合には拡大しません 47,48。 全体として、Alternaria spp.が感染しているかどうかを判断する場合、病原性アッセイには限界があることを認識することが重要です。 宿主植物に効果的に感染することができます。 さらに、Alternaria spp.による一次感染（すなわち、健康な組織への菌糸の侵入）の決定的な証拠がないことは注目に値します。 リンゴの植物に。 「毒素の影響」、「感染」、「二次病原体」、「一次病原体」の違いは微妙に見えるかもしれませんが、無効な治療を避けるためには、病原体の感染生物学を理解することが基本です。 Alternaria の場合、現在の慣行により日和見二次病原体が一次病原体として誤分類され、殺菌剤による不必要で非特異的な治療が行われています。

重要なことは、リンゴの「アルテルナリア病」と他の作物の「アルテルナリア病」の間には強い類似性が存在することです。 ジャガイモでは、初期の疫病を引き起こすと考えられている Alternaria solani の胞子が、主に枯れた葉または枯れかけた葉で生成されます7。 さらに、初期の疫病は熱ストレスや栄養欠乏とも関連しています59,60。 いくつかの作物では、殺菌剤処理の有効性が低い一方で、マグネシウム（ジャガイモ、ケシ）と亜鉛（トマト）の施用により初期の疫病が抑制されたことは、リンゴと同様の生理学的メカニズムがここでも機能している可能性があることを示しています。 同様に、ケシに MgSO4 を葉面散布すると、Alternaria brassicae f. を含むさまざまなカビ菌の病気の重症度が軽減されました。 ソムニフェリ61。 綿の場合、寒さストレスが A. alternata 感染の重要な素因であることが示されています3。 要約すると、いくつかの研究は、Alternaria が栄養欠乏に関連していること、または侵入を肥料で制御できることを実証しています62,63,64,65,66,67。しかし、干ばつ、老化、ウイルスや昆虫の被害、または寒冷ストレス 3,7,68,69,70,71。 したがって、いくつかの非生物的および生物的（たとえば、私たちの結果ではダニ）植物ストレスは、Alternaria spp.による定着を引き起こす可能性があります。 他の植物にもあります。

Alternaria spp.の協会さまざまな種類のストレスに対する影響は、通常、宿主の「弱体化」による感受性の高さによって説明されます2,7。 ただし、「弱化」という用語は、ストレス反応メカニズムなどの生理学的プロセスのさまざまな変化を指します 72、73、74。 「弱った」宿主仮説は、新鮮な植物組織への感染または侵入が起こる可能性があることも示唆していますが、これはアルタナリア属 1、2、7 の腐生生活様式と一致しません。 対照的に、我々は、死んだ植物組織が、Alternaria spp.の定着の重要な前提条件であると仮説を立てます。 リンゴにも、おそらく他の植物にもあると思われます。 新しい仮説は、広範囲にわたるさまざまなストレスがアルテルナリア属菌に関連している理由を説明しています。これらすべてのストレスは壊死を引き起こし、その後、主に腐生性の真菌であるアルテルナリア属菌が定着する可能性があります。

私たちは、さまざまな Alternaria 種、さまざまな品種のさまざまな宿主植物間の多因子相互作用を認識しています。 すべての感受性品種をテストしたわけではありませんが、これらの品種の大部分は遺伝的に関連しており、病気の動態も同様である可能性が高いため、結果は代表的なものであると考えられます。 一方で、多くの研究が、産生される毒素または関連遺伝子座に焦点を当て、さまざまなアルタナリア種/分離株（病型）の「病原性」に焦点を当てています6,44,75,76,77,78。 Alternaria の植物毒は数多く記載されており、最近、14 の異なる分離株で新たな推定上の毒素が生成されることが発見されました 44,79。 この新しい毒素は、既知のアルテルナリア毒素遺伝子領域 (AMT1、AMT4、AMT14) とは関連しておらず、これがアルテルナリアの病原性に関する研究の複雑さの根底にあります。 しかし、我々は、病型の類型とそれらが毒素を産生する可能性では、なぜ殺菌剤と肥料処理が同様に症状を軽減するのかを説明できないと主張する。 これは、あらゆる種類の肥料と栄養素 (上記の参考文献を参照、N、P、K、Mg、Zn、S、Mn) が、複数の非常に効果的な毒素 (数時間以内の壊死) を「不活化」できることを意味します。有害な影響は、感染の重要なプロセスであると考えられています 40、41、80、81 (補足の「考察」も参照)。

葉の栄養不均衡の最終的な原因はさらなる調査が必要ですが、気候要因、特に熱波とその後の気温低下が主な要因として関与していると考えられています17,31。 調査地域における気温の上昇と発情期と極端な気象の頻度の増加は、アルテルナリアの葉斑病の頻度と空間分布（暑い谷の底に限定される）の増加と、22年前（1999年）に初めて果実の斑点が出現したことと一致している。 82. さらに、（それほど暖かくない）温帯気候の地域への葉斑病の継続的な拡大は、気候変動が主要な要因であることを示している23。しかし、低Mn、S、およびMgの利用可能性、取り込み、浸出または隔離の原因となる環境的および生理学的メカニズムは不十分なままである。理解した。 土壌の水の状態の変化（干ばつか浸水か）と不均衡な灌漑体制は、栄養素、特にマンガンの利用可能性に強い影響を与えるため、潜在的な要因となる可能性があります35。重要なのは、アルテルナリア複合施設が実際に気候変動によって誘発された極端な気象によって引き起こされている場合、その影響は次のとおりです。リンゴ生産における重要性は、おそらく近い将来大幅に増加するでしょう。

要約すると、我々の結果は、Alternaria spp. Alternaria の葉の斑点や果実の斑点の主な原因ではなく、日和見病原体です。 アルタナリア属リンゴの葉と果実の既存の壊死組織にのみ定着します。 これらの既存の壊死は、生理的栄養障害 (S、Mn、Mg が関与する) によって引き起こされ、最初は生理的葉斑として現れます。 しかし、他の原因（ワクモ、活性剤の薬害など）も初期壊死を引き起こす可能性があり、アルタナリア属菌による定着の前提条件として機能します。 最後に、我々は、硫黄ベースの葉面肥料が、アルテルナリア関連疾患を制御するための簡単な予防法として使用できることを実証しました。 これらの葉面肥料の施用により、リンゴ生産における世界的な殺菌剤の使用を大幅に削減できる。我々の仮説のように、同じメカニズムが他の作物にも適用され、同様に葉面肥料処理で対処できる場合、潜在的な影響は大幅に悪化するだろう。

すべての野外試験は、2017 年から 2019 年にかけて、イタリア、南チロル州、ライムブルク研究センター (標高 224 度、46.3825°/11.2887°) のリンゴ園で実施されました。 私たちは、「ゴールデン デリシャス」ブロック (2012 年に植栽) と「クリップス ピンク」 (「ピンク レディー®」) ブロック (2000 年に植栽) の 2 つのブロックで実験を確立しました。 成熟したリンゴの木の列は北から南に向けられ、高さ 3.5 メートルの細い紡錘形に成長しました。 実験を 4 つの反復でランダム化されたブロック設計として設定し、行が 1 つのブロックを構成します。 隣接する処理の影響を最小限に抑えるために、ブロック間に 2 つの「バッファー行」を組み込みました。 ブロック内のプロットは、15 の連続した木で構成されていました。 他のプロットに隣接するプロットの最初の 3 本と最後の 3 本の木は評価の対象として考慮されませんでした。

処理の評価（下記参照）のため、果実と葉は一般的な収穫期間中に収集されました（ゴールデンデリシャス：2017年9月19日、2018年9月19日、2019年9月26日、「クリップスピンク」：2017年11月7日、 2018年11月8日、2019年11月15日）。 各プロットから、木の各側 (西と東) に 1 つずつ、ランダムに 2 箱のリンゴ (1 箱あたり約 50 ～ 65 個のリンゴ) を収集しました。 果実は、さらなる評価まで直ちに冷蔵セル（2.5 °C、相対湿度 90%）に移されました。 同じ日に同じ木から葉をランダムに集め、プロットあたり 100 枚の葉 (複製) を木の側面に均等に分割し (片側あたり 50 枚の葉)、紙袋に入れました。 「アルテルナリア」の葉斑を定量化するために、各葉を研究室で視覚的に分析し、葉の壊死面積のパーセント（0%、0 ～ 5%、5 ～ 10%、10 ～ 15%、 15 ～ 20%、20 ～ 30%、> 30%)。 リンゴごとに検出された果実斑点の数 (0、1 ～ 2、3 ～ 5、> 5) を考慮して、果物も侵入クラスに割り当てられました。 結果はプロットごとにプールされ、1 つの複製/データ ポイントを表します。 「クリップス ピンク」の殺菌剤処理では果実の斑点がほとんど見られなかったため、評価されませんでした。

果樹園は、肥料や特定の Alternaria 活性剤を使用しないことを除いて、ナシ果実の総合栽培のガイドラインに従って管理されました 83。 したがって、我々の対照区は、特定のアルタナリア処理を行わない統合管理を表し、一方、他の実験区は、統合管理と対応する実験処理を加えたものである。 テストされた治療法は、以前の結果と現場観察に基づいて開発されました（補足図13を参照）。 アルタナリアの葉斑点に対する私たちの治療法は、ゴールデンデリシャス硫酸塩ミックス（SBF、組成については補足表1を参照）用でした。 「クリップス ピンク」では、2017 年に硫黄懸濁液チオプロン® (UPL Italia srl; 2017: 0.605 l/hl = 500 g S/hl) を使用しました。 チオプロン®は販売基準に反してリンゴに白いコーティングを引き起こしたため、2018年に使用量を減らし（0.242 l/hl = 200 g S/hl）、2019年にはチオプロン®を別の一般的な硫黄製品（微粒子硫黄）に置き換えました。 ）、Thiovit®（シンジェンタ イタリア スパ）。 Thiovit® を推奨用量 (240 g/hl = 190 g S/hl) に従って適用しました。 葉斑点への影響は硫黄の種類/製品に依存しないため、別の硫黄製品へのこの移行は結果に根本的な影響を与えませんでした（補足図13を参照）。 これまでに説明したすべての処理を「硫黄ベースの葉っぱ肥料」(SBF) と呼びます。 シーズンごとの散布頻度は、ゴールデン デリシャスでは 2017 年に 4 回、2018 年と 2019 年に 5 回でした。「クリップス ピンク」の場合、3 年間すべて (2017 ～ 2019 年。補足表 1 を参照) の散布頻度は 1 シーズンあたり 6 回でした。 すべての処理は、使用水量 15 hl/ha の実験用果樹園噴霧器 (軸流ファン、インジェクター ノズル) によって適用されました。

SBF の有効性を現在の実践と比較するために、Alternaria の葉斑点と果実斑点を制御するためにいくつかの殺菌剤が適用された処理もモニタリングしました。 「ゴールデン デリシャス」では、2 つの異なる作用機序を持つ 2 つの活性剤をテストしました: (I) ホスホン酸カリウム (FRAC コード: P 07; 2017: "FosfiD'oR 250"、Orius; 2018–2019: "Century Pro"、BASF ) および (II) ジフェノコナゾール (FRAC コード: 3; 2017 ～ 2019 年: 「スコア 10 WG」、シンジェンタ)。 適用用量は次のとおりでした: FosfiD'oR 250: 3 L/ha (45.3% ホスホン酸カリウム)、Century Pro: 1.9 L/ha (50.4% ホスホン酸カリウム)、Score 10 WG.: 750 g/ha (10% ジフェノコナゾール)。 これらの殺菌剤はそれぞれ個別にテストされました。 「クリップス ピンク」は生育期間が非常に長く (11 月に収穫)、適用頻度は各活性剤の法的規制により一定数に制限されているため、殺菌剤混合処理をテストしました。 殺菌剤ミックスには次の殺菌剤が含まれていました: Syllit® 65 (UPL)、1,38 kg/ha (65% Dodine) 含有、Polyram® DF (BASF)、2,6 kg/ha (70% Metiram)、Geoxe ® (Syngenta)、0.45 kg/ha (50% フルジオキソニル) 含有。 すべての殺菌剤は適切な農業慣行に従って、通常は真菌感染症のリスクが高い降雨後に適用されました。 生育期ごとの殺菌剤の処理頻度は、「ゴールデンデリシャス」は2017年：8回、2018年：5回、2019年：11回、「クリップスピンク」は2017年：11回、2018年：7回、2019年：8回でした。統計については、すべての結果殺菌剤プロットが含まれており、さまざまな殺菌剤の平均効果を表しています (「ゴールデン デリシャス」: 2 つの活性剤、「クリップス ピンク」: 4 つの活性剤)。

私たちの圃場試験 (上記の実験設定) の中で、2017 年に、葉斑点に対するさまざまな葉の肥料と肥料濃度の影響をさらにテストしました。 使用した肥料は、Thiopron® (UPL Italia srl)、Fytofert® S (Desangosse Italia srl)、硫酸塩ミックス (表 S1 を参照) でした。 3 つの肥料はすべて 2 つの異なる濃度で施用され、最終濃度が 50 g 硫黄 hl-1 および 500 g 硫黄 hl-1 になるように常に補正されました (Thiopron®: 61 ml hl-1 および 606 ml hl-1、68)。 ml hl-1 および 685 ml hl-1、硫酸塩混合物：表 S1 に記載の 500 g S hl-1、50 g S hl-1 に対して、MgSO4 を 318.8 g hl-1 に減らしました。

硫酸塩混合物 (S 混合物、補足表 1 を参照) が Alternaria spp. に対して殺菌効果があるかどうかをテストするために、実験室で殺菌活性スクリーニングを実施しました。 そのために、コントロールとして PDA、現場で適用される濃度の S-Mix と混合した PDA (PDA + S-Mix) (上記を参照)、および S-Mix と 1 を混合した PDA を充填した 6 × 4 マイクロタイター プレートを使用しました。そのうちの /10 の濃度 (PDA + 1/10 S-Mix) を使用しました。 3 つの培地すべて (PDA、PDA + S-Mix、PDA + 1/10 S-Mix) に 4 つの異なる Alternaria 分離株 (A02/F172、A02/F152、A15/271、A15/31) をそれぞれ 3 回ずつ接種しました (分離株あたり 9 ウェル）。 接種後、プレートを25℃のインキュベーターに移した。 菌糸体の成長（直径、mm）を24時間後に定規で測定し、対照（PDA）と比較しました。 各複製から、直交配置での 2 つの測定により直径が決定されました (技術的複製)。 菌糸体の成長は、培地（PDA）中の1/10 S-MixおよびS-Mixによって減少しませんでしたが、わずかに増加しました（p < 0.001;補足図13）。 1 つの分離株 (A02/F172) の増殖には濃度間の差異が見られなかったため、培地 (濃度) と分離株の間の相互作用は有意でした (p = 0.007)。 したがって、S-Mix には殺菌効果はありません。

栄養素分析のため、圃場試験（2017年から2019年）内のさまざまな区画/処理から葉をサンプリングしました。 3 年間にわたって、「ゴールデン デリシャス」では 99 の区画から採取した 891 本の木から約 9,900 枚の葉をサンプリングしました。「クリップス ピンク」では、それぞれ 9,100 枚、819 枚、91 枚でした。 1 つの区画から収集したすべての葉をプールしたため、各区画は複製とその後の統計分析のデータ ポイント。 すべての葉を上記のように葉斑について評価し、続いて栄養素濃度を分析した。 そのために、葉 (プロットあたり 100 枚) を 60 °C のオーブンでコンパートメント乾燥機内で少なくとも 72 時間乾燥させ、分析前に葉柄を取り除きました。 化学分析は、ライムブルクの土壌植物分析研究所 (ISO 17025:2005 に従って認定) によって実施されました。 窒素は、DIN EN ISO 16634-1:2009 (Dumas による) に従って元素分析装置で分析されました。 他の栄養素 (P、K、Ca、Mg、B、Fe、Mn、Cu、Zn、S) は、EPA 3052 1996 + EPA 6010D 201 に従って、誘導結合プラズマ発光分析法 (ICP-OES) で分析されました。すべての所定の栄養素濃度「乾燥重量」当たりです。

リンゴ園は、近くに同じ種類のリンゴであっても、アルテルナリアの葉斑や果物の斑点病の発生率が大きく異なる場合があります。 葉の栄養素分析を検証するために、4 つの「ゴールデン デリシャス」果樹園のペアを選択しました。 管理の影響を最小限に抑えるために、果樹園ペアは 2 つの基準に基づいて選択されました。(I) 各ペアは同じ農家 (3 人の農家) によって管理され、(II) 各果樹園ペアは最後の ~ 5 件を示す 1 つの果樹園から構成されます。何年も侵入がないか、最小限しか発生しておらず、定期的に非常に強い侵入が発生することを特徴とする果樹園（自然の豊かさ）。 ライムブルクの果樹園と外部の果樹園を組み合わせたので、1 つのペアは基準 I) を満たしていませんでした。 すべての果樹園から、2018年に3回（5月25日、7月20日、9月7日）、2019年に2回（5月17日、7月9日）、果樹園ごとおよび時点ごとに2回繰り返し、15日から50枚の葉をサンプリングしました。レプリケートごとのツリー。 最初のサンプリング日 (2018 年 5 月 25 日) に、果樹園ごとに 3 つの複製を採取しました。 上で説明したように、葉の栄養濃度を分析しました。

研究で使用されたすべての分離株は、ライムブルクの菌類培養コレクションから入手され、最初はイタリアの南チロルにあるさまざまな果樹園のリンゴの葉の斑点と果実の斑点から分離されました。 分離株の系統分類は、Armitage らによって提案された方法を使用して決定されました。 その結果、2 つの分離株が A. alternata sspp に属していることが明らかになりました。 tenuissima、残りの 2 つの分離株は A. alter sspp に属していました。 樹木。

PDA プレート (分離株あたり 2 枚) に、Laimburg コレクションからの Alternaria 分離株を接種し、25 °C のインキュベーター内に保管しました。 1週間後、成長した菌糸体から1.5cm3の立方体を切り出し、200μlの滅菌0.03%トゥイーン溶液を加え乳鉢で粉砕しました。 菌糸体が完全に粉砕された後、4.8 mlのトゥイーン溶液を乳鉢に加えました。 750μlの菌糸体懸濁液をピペットでV8プレート（分離株当たり4枚のプレート）に移し、予め浸した（滅菌水）セロハンディスクで覆った。 密閉プレート（パラフィルム）を２５℃の恒温室に保管し、８時間のブラックライト（Philipps TL-D 36W BLB 1SL/25）および１６時間の暗闇という照明プログラムを適用した。 ３週間後、セロファン菌糸体層を一対のピンセットで除去し、８ｍｌのトゥイーン溶液とともに５０ｍｌファルコンチューブ（チューブ当たり２枚のプレート）に入れた。 Falcons チューブを 1 分間ボルテックスし、5 分間超音波浴 (40 kHz) に置き、再度 1 分間ボルテックスしました。 菌糸体を胞子から分離するために、続いてファルコンチューブの内容物を濾過し（80μmメッシュ）、得られた液体部分を血球計数器（フックス・ローゼンタール計数室）で胞子密度について分析した。 すべての胞子懸濁液を最終密度 1.25 × 106 胞子/ml まで希釈しました。

この実験では、さまざまな葉の損傷が Alternaria spp. の感染に及ぼす影響をテストしたいと考えました。 葉損傷処理には 4 つの異なるタイプがありました。「なし」 = 健康な組織、「1 時間前」 = 接種 1 時間前にコンビネーションペンチで損傷、「7 日前」 = 7 日前にコンビネーションペンチで損傷接種前、「ダニ」 = 現在ヨーロッパワクモ (Panonychus ulmi) に深刻な攻撃を受けている果樹園から接種当日に採取された葉。 これらの収集された葉には、目に見えるダニの被害がありました。 近くの農場（約 3 km の距離）に由来するダニに侵された葉を除き、すべての葉はライムブルク研究センターの果樹園から収集されました。

「７日前」の傷害タイプについては、実験開始の７日前に、「ゴールデンデリシャス」の葉にペンチで木に印を付け、傷を付けた。 損傷した葉、健康な葉、およびダニによって損傷された葉を実験接種日（2019年5月29日）の朝に収集し、コルクボーラー（直径15 mm）で葉ディスクを切断するために使用しました。 中肋が含まれないように、葉あたり 4 枚のディスクをランダムに切断しました。 他の病原体やカビの存在の可能性を減らすために、ディスクを 3% 次亜塩素酸ナトリウム溶液と 70% エタノール溶液にそれぞれ 2 秒間浸漬し、滅菌水で 10 秒間洗浄しました。 その後、「1 時間前」の損傷タイプに属するリーフディスクをペンチで損傷しました。 我々は、分岐群 A. alternata sspp に属する 4 つの異なる分離株を選択しました。 tenuissima (A18/F01/14、A18/F03/09) および 2 つの A. alternata sspp。 樹木状植物 (A18/F05/11、A18/F10/14; Armitage et al.75 による) 分離株は、もともと南チロルのさまざまな感染した果樹園から分離されました。 私たちの実験設定は、因子「損傷の種類」と因子「分離株」の完全交差設計であり、両方とも 4 つの異なる分離株を使用し、結果として 16 の治療の組み合わせが得られました。 各治療の組み合わせ（4 枚のペトリ プレート）に対して 4 つの技術的複製（プレートあたり 4 枚のディスク）からなる 4 つの複製を使用しました。

小さなペトリ皿（直径５５ｍｍ）をオートクレーブ処理したガラスビーズ（直径３ｍｍ）の層と滅菌水（３ｍｌ）でビーズが覆われるまで満たした。 各プレートには、同じ処理に対応する 4 つのリーフ ディスクを設定します。 4 つの分離株に従って、4 つの異なる胞子懸濁液を用意し、その 60 μl をピペットで各葉ディスクの損傷部分に適用しました (中央)。 対照（n = 4）として、各「損傷の種類」の葉ディスクに上記のように適用した滅菌水を使用しました。 結論として、各ペトリ皿には、1 つの「損傷の種類」のリーフディスクと 1 つの分離株または純水 (対照; 合計 5 処理 × 4 分離株 × 4 反復 = 80 皿) が含まれていました。 続いて、ペトリ皿を25℃、相対湿度65％の気候変動チャンバー（Proclimatic ACLIL 900 Lt）に置き、同時の日長に応じた照明プログラム（15.5時間明/8.5時間暗、5000ルクス）を設定しました。 蒸発による損失のため、3日目、6日目、9日目に各プレートに2mlの滅菌水を加えました。

13 日後 (2019 年 6 月 12 日)、次のクラス [% 壊死領域] に従って、すべてのディスクの壊死性葉斑点を評価しました:0、0 ～ 1、1 ～ 5、5 ～ 10 ～ 10 ～ 15、15 ～ 20、 20–30、> 30。数値データへの変換は上記のように実行されました (主なフィールド実験)。 注: 対応する対照の壊死領域と比較した壊死領域の変化を評価しました。壊死領域は、異なる「損傷の種類」治療により接種前にすでに異なりました。

成熟した「ゴールデン デリシャス」リンゴは、2019 年 9 月 18 日にライムバーグ研究センターで収穫されました。研究室では、70% エタノール溶液に浸したペーパータオルでリンゴの表面をきれいにしました。 マーカー ペンを使用して、リンゴの表面を 3 つの等しい球形セグメントに分割しました。 各セグメントは、3 つの損傷タイプのいずれかに割り当てられました (治療、n = 4): 針 = 注射針で損傷 (5 mm の深さの穿刺)、サンドペーパー = サンドペーパーで損傷 (損傷したリンゴの ~ 6 cm2)表面）、なし = 未処理の健康な組織。 ブラシを用いて、損傷部位および健康な組織に胞子懸濁液を接種した（分離株A18/F10/14、A. alternata sspp. arborescens）。 対照として、同じ損傷タイプの追加の 4 つのリンゴに胞子懸濁液と同様に適用した滅菌水を使用しました。 空気湿度を高めるために、底に水に浸したペーパータオルを敷いたプラスチックの箱にリンゴを移した。 リンゴを乾燥した状態に保つために、リンゴを箱内の金属格子上に置きました。 ボックスを気候変動室（Proclimatic ACLIL 900 Lt、25 °C、65% RH）にセットした蓋（気密ではない）で覆い、同時日長（12 時間明/12 時間暗）に応じた照明プログラムを適用しました。 タオルを濡れた状態に保つために、4 日目と 8 日目に水を補充しました。 12日後、リンゴの果実の斑点と壊死形成を以前と同様に管理した。

私たちは、(a) 保存中に果実の斑点の数とサイズが増加するかどうか、(b) 健康なリンゴが保存中に近くの感染したリンゴに感染する可能性があるかどうかをテストしたいと考えました。 そのため、「ゴールデン デリシャス」リンゴは、アルタナリア果実の斑点が重度に蔓延している果樹園から 9 月 (一般的な収穫日) に収穫されました (平均: リンゴ 1 個あたり 10 個の斑点)。 健康なリンゴは、寄生されていない別の果樹園から採取されました。 果実の斑点のない健康なリンゴは、感染したリンゴと一緒にプラスチックの箱に入れられました（2000年9月27日）。 両方の箱を室温 (15 ～ 20 °C) で保管し、1 つは 65% RH (寄生虫 10 個、健康なリンゴ 15 個)、もう 1 つは 100% RH (寄生虫 11 個、健康なリンゴ 10 個) でそれぞれ保管しました。 ２ヶ月後（２０００年１１月２５日）、リンゴの果実の斑点を再度管理し、貯蔵前のものと比較した。

Alternaria spp. かどうかをテストします。 壊死組織に定着するため、畑で人為的に葉の壊死斑点を誘発しました。 そのために、除草剤スポットライト® プラス (Belchim; カルフェントラゾンエチル; 濃度: 3 ml/L) を、ハンドスプレーを使ってライムブルク果樹園の「ゴールデン デリシャス」の葉に噴霧しました。 2019 年 7 月 8 日に、主要な圃場試験内でプロットあたり 6 本の木 (n = 4) が処理されました。 得られた人工的な葉の斑点は、自然の葉の斑点と明確に区​​別できました。 2019年9月3日と10月14日に、除草剤処理区と自然葉斑のある対照区から明らかな症状のある区当たり5枚の葉を採取した。 採取した生葉をコピー機でスキャンしてカラー画像（300dpi）を作成しました。 カラー画像に基づいて、ImageJ ソフトウェア 84 を使用して壊死スポットのサイズ (cm2) を決定しました。 スキャン後、葉を紙袋内で60℃のコンパートメント乾燥機で少なくとも72時間乾燥させました。 次に、次のようにして乾燥葉から胞子を洗浄した。区画の乾燥葉を粉砕し、それぞれ60mlの脱イオン水とともに200mlビーカーに満たした。 ビーカーを２分間（２００ｒｐｍ）振盪し、続いて超音波浴（４０ｋＨｚ）に３分間移し、再度５分間（２００ｒｐｍ）振盪した。 水と葉の混合物を濾過し（80μmメッシュ）、得られた濾液を使用して、血球計（フックス・ローゼンタール計数室）を用いて胞子密度を分析した。

以下の分析は、線形混合効果モデル (LMM) 分析に基づいています。 すべての分析は R バージョン 4.0.2 (R Core Team、2019) で実行されました。 ランダム フォレスト分析は、randomForest パッケージ バージョン 4.6-1485 を使用して実行されました。 線形混合モデルは nlme バージョン 3.1-148 を使用してフィッティングされ、主成分分析は vegan パッケージ バージョン 2.5-686,87 を使用して実行されました。

グラフ分析と統計分析のために、序数の葉の斑点と果実の斑点のデータは、クラスの中間点を使用して加重平均 (平均壊死面積 [%]、リンゴあたりの果実の斑点の平均数) を計算することによって連続データ (パーセンテージ) に変換されました。プロットの各木の側面。 葉の斑点および果実の斑点の減少は、(平均壊死領域処理 / 平均壊死領域対照)-1)*100 によって計算されました。

葉斑点と果実斑点に対する SBF と殺菌剤 (処理) の効果を、2 つの処理のそれぞれと各リンゴ品種 (「ゴールデン デリシャス」と「クリップス ピンク」) についてそれぞれ個別に分析しました。 「壊死した葉の面積」(%) と「果実斑点の数」(#fruit-1) をそれぞれ応答変数として使用しました。 固定効果は「治療」(SBF 対対照、または殺菌剤対対照) でした。 複数年のデータがあるため、個別の傾き (年 | ブロック) を持つ入れ子になった変量効果として「年」 (2017 ～ 2019 年) とブロック (複製; n = 4) を指定しました。

Alternaria の葉斑病に対する感受性が栄養素濃度 (Mg、Mn、S) に関連しているかどうかをテストするために、応答変数として Mg、Mn、S 濃度を持つ LMM を使用しました。 「果樹園タイプ」（高い普及率と低い普及率）を固定効果として設定しました。 「日付」(n = 5、果樹園ごとにそれぞれ 2 つの複製) と「果樹園 ID」(2018: n = 8; 2019: n = 6) は、個別の傾き (日付|果樹園 ID) による変量効果として指定されました。

人工（除草剤）で誘発された葉斑点および自然の葉斑点から抽出されたオルタナロイド胞子の「胞子密度」を従属変数として設定しました。 固定効果は、「葉壊死のタイプ」(人工対自然) と葉収集の「日付」(2019 年 9 月 3 日対 2019 年 10 月 14 日) とそれらの相互作用でした。 「ブロック」(複製; n = 4) をランダム効果として設定しました。

葉ディスクの相対的な壊死葉面積を従属変数として使用しました。 各反復の値は、対応する技術的反復の平均を表します (n = 4)。 「損傷の種類」（「なし」対「1 時間前」対「7 日前」対「ダニ」）および「隔離」（A18/F01/14 対 A18/F03/09 対 A18/F05） /11 対 A18/F10/14) を固定効果、およびそれらの潜在的な相互作用として設定しました。 「複製」(n = 4) がランダム効果として指定されました。

葉の栄養濃度と葉斑の発生率を関連付けるために、ゴールデン品種とピンク品種のランダム フォレスト分析を別々に実行しました88。 各フォレストについて、10,000 本の木を成長させ、各ノードでの分割のために 4 つの予測子をランダムにサンプリングしました。 変数は、残差二乗和で測定されるノードの不純物の平均減少によってランク付けされ、不均衡な影響を与える変数が目視検査後のさらなる分析のために選択されました。

続いて、選択した栄養素を全体的な線形混合モデルで使用して、統計検出力を最大化するために 2 品種の葉斑病の重症度 (対数変換) に対する影響をテストしました。 同じプロットで何年にもわたって繰り返し観察されたことを説明するために、ランダム効果が含まれています。 固定効果には、品種、選択された葉の栄養素、および各葉の栄養素と品種間の双方向相互作用が含まれます。 後者では、品種ごとに各栄養素と葉の斑点の間に異なる関係を持つことができます。 栄養素間の相互作用をさらに調査するにはデータが少なすぎました。

選択した予測因子のうち 2 つ (S と Mg) は強い共線性があり (補足図 4)、両方を同じモデルに含めると回帰係数の推定値が不安定になりました。 この問題を回避するために、2 つのアプローチを使用しました。 まず、S と Mg のデータのみに対して主成分分析を実行しました。 予想どおり、最初の軸はこれら 2 つの要素の変動の大部分 (90.1%) を説明しました。 続いて、PCA 軸 (1 & 2) スコアを LMM (mod1、補足表 5) の予測因子として使用して、葉斑点に対する S と Mg の影響を同時に捕捉しました。 次に、予測因子として Mg (mod2) または S (mod3) を除いた 2 つの LMM を当てはめ、AIC 値に基づいてモデルの当てはめを比較しました89。 尤度比検定 (mod2a) を使用して、最適モデル (mod2) をさらに単純化しました。

この研究で使用された植物材料は管理された栽培から調達され、すべての収集は野生植物の収集に関する制度的、国内的および国際的なガイドラインに従って行われました。

現在の研究で使用および/または分析されたデータセットは、https://doi.org/10.5281/zenodo.7963642 から自由にアクセスできます。

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現場でのサポートについては、Markus Kelderer、Claudio Casera、Thomas Facchini、Gazmend Arslani、Bekir Musliu、研究室でのサポートと分離株の提供と同定については Michaela Bertagnoll および Sabine Oettl に感謝します。 真菌の診断とディスカッションについては Yazmid Reyez Domingues に感謝します。 以前の草稿を批判的に読んでくださったMartijn Bezemer氏とEmilia Hannula氏に感謝します。 この研究は、Apple Consortium South Tyrol (イタリア/テルラン) (Prot. Nr. VZL.00/5881/85.00/MO-cg) から資金提供を受けました。 ERJW は、NWO-Rubicon Mobility Grant (オランダ科学研究機構、契約番号 019.181EN.01) によって支援されました。

Terra Institute、Säbenertorgasse 2、39042、ブリクセン、BZ、イタリア

ウルリッヒ・E・プレヒスル, ヴェルナー・リッツォーリ & クラウス・マーシャル

持続可能な農業生態系グループ、農業科学研究所、環境システム科学部、チューリッヒ工科大学、Universitätstrasse 2、8092、チューリッヒ、スイス

ER ジャスパー・ワブス

陸生生態学部、オランダ生態学研究所 (NIOO-KNAW)、私書箱 50、6700 AB、ヴァーヘニンゲン、オランダ

ER ジャスパー・ワブス

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UEP は、KM がこの役割を果たした果物の貯蔵実験を除く、すべての実験を設計、実装、評価しました。 WR は、フィールド試験 (フィールド処理) を共同設計および実施し、Alternaria 殺菌剤の長期テスト (>15 年) を実施しました。 UEP と ERJW はデータ分析を実行し、原稿を執筆しました。 著者全員がこの原稿に対して建設的なコメントを寄せてくれました。

Ulrich E. Prechsl への対応

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Prechsl、UE、Rizzoli、W.、Marschall、K. 他。 Alternaria の葉斑点とリンゴの果実の斑点を殺菌剤を使用せずに管理すると、Alternaria spp. が示されます。 二次植民者として。 Sci Rep 13、8431 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35448-2

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受信日: 2023 年 1 月 10 日

受理日: 2023 年 5 月 18 日

公開日: 2023 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35448-2

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